豬切口腹壁疝修復模型下交聯及非交聯生物網塞組織學及生物力學評價
采用補片的無張力疝修補術是20世紀末劃時代的手術，被譽為20世紀疝修補手術的“里程碑”。
理想的腹壁缺損修補材料要有相當的機械張力，耐受感染，盡量減少切口疼痛、局部不適、切口感染、血清腫、腸粘連和腹壁腸漏等較難處理的后遺癥發生，以免影響生活質量。
疝和腹壁外科使用修補材料的研究進展與學科發展密切相關。近年來，各類生物源性材料的疝修補片（biological mesh）不斷涌現，由于其植入后不引起強烈的炎癥反應，有可吸收、可降解的特點，且具有可觀的抗拉伸強度及耐受感染能力，應用前景良好。
但是由于生物補片在體內會逐步降解，如果生物補片的降解快于宿主細胞浸潤細胞外基質、細胞分裂、膠原沉著和新生血管形成，那么新形成組織的總體量和強度將不能充分達到腹壁修補的目的。
之前，我們介紹了一篇美國國立衛生研究院于2013年發表的關于生物材料強度方面研究的文獻進行了解讀，今天我們選取另外一篇文獻提供參考。
美國國立衛生研究院，簡稱NIH，位于美國馬里蘭州貝塞斯達（Bethesda），是美國最高水平的醫學與行為學研究機構，初創于1887年，任務是探索生命本質和行為學方面的基礎知識。
注：由于水平有限，翻譯中有錯誤之處，萬望海涵。
豬切口腹壁疝修復模型下交聯及非交聯生物疝補片組織學及生物力學評價
摘要
研究背景——本研究的目的是對交聯生物疝補片（Peri-Guard，Permacol）及非交聯生物疝補片（AlloDerm,Veritas）進行生物力學性能及組織學重構特性評價。評價模型為豬的切口腹壁疝，評價周期為12個月。
研究設計——在48只Yucatan小豬的雙側腹壁制造切口疝，21天后應用襯墊方式進行修補。樣品分別與置入后1個月，6個月，12個月取出進行生物力學及組織學分析。取出的樣品分別與未植入的樣品及植入部位的腹壁組織進行生物力學性能對照。統計顯著性水平由Fisher最小顯著差檢驗后的方差分析確定。
結果——經所有修補部位在1,6,12個月都呈現出相似的拉伸強度，所有植入疝補片材料沒有顯著性差異（P>0.05）。無論植入材料的初始強度如何，植入部位的豬腹壁組織在所有時間點沒有呈現強度增加。在組織學上，相比于交聯過的材料，未交聯的材料呈現出更早期的細胞長入（P<0.01）、細胞外基質沉積（P<0.02）、疝補片支架降解（P<0.05）及新血管形成，而交聯材料在植入12個月以后上述特性也都可呈現。
結論——應用生物疝補片進行疝修補，局部拉伸強度不受材料初始強度及材料是否交聯等特性影響。雖然經過交聯的材料在植入后短時間內其組織學特性如細胞長入、新血管形成等組織學特性有所差異，長時間以后這些差異基本消失。除了交聯以外，材料來源的組織類型及處理條件等也會對這些差異造成影響。
在腹壁切口手術中20%的患者會因為切口疝產生并發癥【1-3】。簡單縫合會造成不可接受的31%到54%的復發率【4-5】。采用人工合成的網狀材料可以使復發率降低2%到36%，目前已經成為切口疝的標準修復方式【4-7】。然而，任何人工材料植入本身就可能形成新的并發癥，首次切口疝修復后傷口感染的機率可高達5%-30%【8】。管理術后感染有時需要將人工材料取出，這會造成疝的復發，從而需要進一步處理。近期在臨床上防止感染的新材料使用量劇增，這些材料在高風險感染的傷口部位使用可以盡可能減少并發癥。目前還沒有一種材料可以適用于所有情況。然而，近期新型生物材料的研發展現出很好的前景，這些材料可以使用在傷口污染嚴重的部位。
脫細胞的生物材料一般來源于人體或者動物的表皮、小腸粘膜、心包，是一種新型的植入材料。經過脫細胞和去除免疫原性處理以后，只剩下細胞外基質框架，有利于宿主細胞本身的長入【9-10】。一旦被植入人體，隨著宿主膠原在材料上的沉積，材料的細胞外基質就逐漸被降解，材料的重構由此開始。由此，生物材料作為疝修復補片可以保持足夠的力學性能以防止疝的復發。一些生物材料經過交聯處理可以有效抵抗在體內的降解。雖然一些臨床前研究給出了一些交聯和未經交聯材料的特性【11-17】，目前在人體上這些材料在疝修補方面的長期臨床數據還沒有。
本研究的目的就是在豬的切口疝模型下對比交聯和非交聯生物材料對組織修復重建的影響。由于材料來源和交聯處理工藝的不同，我們可以看到它們在材料的物理性能和宿主組織對它們的反應方面都有不同，我們在這些材料植入1，6，12個月分別取出進行了研究。
方法
本研究在華盛頓大學動物醫療委員的允許情況下展開。48只雌性Yucatan小豬被用來進行實驗，它們采用特定的規程進行飼養和處理。手術中有嚴格的無菌環境。本研究中涉及的生物材料包括， Peri-Guard （交聯牛心包）、 Permacol (交聯豬皮)、Veritas (未交聯的牛心包)、AlloDerm (未交聯的人皮)。
采用雙側腹壁切口的方式制造Yucatan小豬的腹壁疝，21天后采用腹壁縫合的方式進行修補。切口長125px，切開表皮、皮下脂肪、筋膜和肌肉腱膜，但不切開腹膜。腹壁肌肉和筋膜保持開放。皮下脂肪和蜂窩組織進行3-0線間斷縫合操作，表皮也同樣縫合。表皮應用膠粘密封以防止內部流體在術后48-72小時流出。術后為防止感染，采用口服頭孢氨芐，總共5天，每12小時20-25mg/kg體重。
腹壁缺損保留其自然生長21天，然后用8X250px生物補片修復。修復中遵循生產廠家的使用規范，打開腹壁缺陷到腹膜。雙側腹壁都進行修復，把補片放在腹膜前部，使其周圍有更多的血管環境。補片按照長邊方向250px，短邊方向200px的方向放置。間隔約75px，距邊至少25px的方式進行縫合。補片覆蓋腹壁的重疊部分大約為2-75px。所有切口采用雙層間斷方式縫合。縫合后用表皮膠進行密封。術后防止感染處理同上所述。
在1，6，12個月的時間間隔，分別對動物實施鎮靜后處死。然后從中線打開腹壁，首先觀察修復材料的表面狀態。同時取下周圍宿主腹壁組織，用以進行張力測試對比。修復的材料與宿主組織的交界處由于發生重構已經很難區分，我們取材時選用修復區域中間的修復材料。我們在進行材料測試時，不會刻意把生物材料單獨分離出來，而是把修復地點的整個組織和材料一起取出作為樣本。樣品一般為4X100px大小，其中1X100px用于進行組織測試，余下的3X100px部分用于材料拉伸實驗。
用特定的材料實驗機進行測試，拉伸試驗采用0.42mm/s的速率進行。材料可以承受的最大的在和用牛頓單位來度量（N），最大應力用最大的載荷除以材料的截面寬度獲得（N/cm）。每個植入材料采用8個樣本進行統計測量，豬的自體組織測量樣本量為10，用以進行生物材料變化和豬自體組織之間的對比。
獸醫病理醫生采用特定方式制作樣本用以進行組織分析。在5-10的區域中，在100倍放大的觀察視野下對各種組織和材料變化做出分級，如宿主細胞滲透、細胞類型、材料細胞外支架分解、材料組織框架分解、纖維化覆蓋程度、神經血管長入等等，然后給出一定的評分。分數高表明材料重構好，上述宿主細胞滲透、材料細胞外支架分解、材料組織框架降解、神經血管長入等效果優異，而且炎癥反應水平低且纖維化水平低。每一種材料都會根據上述六種分類情況給出平均組織綜合評價水平分數。
結果
生物補片材料的初始單向拉伸強度如下： Veritas, 89.6 ± 9.7 N; AlloDerm, 253.0 ± 15.2 N; Permacol, 317.2 ± 23.6 N; Peri-Guard, 169.5 ± 18.3 N (Fig. 1A)。忽略樣品的厚度差異，應力強度為: Veritas, 29.9 ± 3.2 N/cm; AlloDerm, 84.3 ± 5.1 N/cm; Permacol, 105.7 ± 7.9 N/cm; Peri-Guard, 56.5 ± 6.1 N/cm (Fig. 1B)。初始強度方面，Permacol比其它材料都強很多，AlloDerm比Peri-Guard和Veritas要強，Peri-Guard比Veritas要強。
初始情況下四種生物材料的剛度也根據力和變形的彈性區域的斜率進行了計算。它們的剛度分別為： Veritas, 10.0 ± 1.3 N/mm; AlloDerm, 18.2 ± 1.3 N/mm; Permacol, 58.3 ± 4.0 N/mm; Peri-Guard, 34.8 ± 2.7 N/mm (Fig. 1C)。由此可以看出它們的顯著差異。Permacol的剛度最大，Peri-Guard其次，AlloDerm第三，Veritas剛度最差。（剛度越大，表示在一定外力下越不容易變形）。
所有四種材料在植入前都比植入后1，6，12個月顯著強度要大，而且剛性更大。此外，雖然四種材料在植入前強度和剛度有不同程度的差異，植入1，6，12個月后，這種差異變得不顯著。
如圖1所示，材料在植入后最大載荷的變化情況如下： 20-30 N，Veritas； 14-37N，AlloDerm；23-35N，Permacol；29-40N，Peri-Guard。拉伸應力的變化情況如下：7-10 N/cm，Veritas；5-13 N/cm，AlloDerm；7-12 N/cm，Permacol；9-14 N/cm，Peri-Guard。剛度的變化情況如下：0.9-2.6 N/ mm，Veritas,；0.6-3.6 N/mm，AlloDerm；1.1-5.8 N/mm，Permacol；1.9-5.8 N/mm，Peri-Guard。同樣作為對比材料的豬自體腹壁材料的力學特性如下：最大載荷，10-17N；應力，3.4-5.6N/cm；剛度，0.8-1.1N/mm。在植入后的不同時間點，植入材料和自體組織材料的差別并不明顯，初始強度和剛度更大的材料并不對應植入后材料強度和剛度的增加。
圖1 生物材料隨植入時間其力學性能的變化
組織學評價的差異體現出了材料的不同來源（例如表皮和心包）和是否交聯。六個組織學評價的特征是：細胞滲透、細胞類型、細胞外基質分解、材料支架降解、纖維化覆蓋程度、神經血管長入。對每一個樣本，分別對這六種評價指標打分，然后每一種材料得到一個平均分。
從結果可以看出，兩種未經交聯的材料（Veritas和AlloDerm）在植入一個月后綜合分數都高于交聯的材料（ Permacol和Peri-Guard）（圖2），表明它們的重構特性更好。此外，植入一個月以后的評價分數來看，Veritas比AlloDerm分數更高。植入后六個月，兩種未經交聯的材料比兩種交聯過的材料的分數都高。每一種材料的評價分數都不會維持不變。所有四種材料的分數都會隨植入時間的增加而提高。在所有考察的時間點上，Veritas都有最高的分數，相比于另一種未經交聯的材料AlloDerm也是如此。
圖 2 生物材料植入后的組織學綜合評價分數
另外，組織學評價也顯示出未經交聯的材料初始情況下細胞滲透特性要強于交聯材料。但植入6-12個月以后，這樣的區別消失了（圖3A）。此外，兩種未經交聯的材料在植入后一個月細胞滲透都達到峰值，此后6-12個月并沒有顯著增加。然而，兩種交聯材料在植入后細胞滲透特性會一致增強，而且在植入12個月后宿主細胞甚至可以長到材料的中間部位。
對長入細胞類型來說，在植入后1個月和6個月，相比AlloDerm，Peri-Guard檢測到了更少的炎癥細胞和更多的成纖維細胞，其他的參數對照差別并不明顯。隨著植入時間的推移，在所有四種材料中都觀察到了更少的炎癥細胞和更多的成纖維細胞。植入12個月時，Veritas的成纖維細胞最多而炎癥細胞最少。
細胞外基質的分解在植入一個月后的未交聯材料中明顯高于交聯材料，Veritas是最明顯的，相比AlloDerm其次。在植入后6個月， Veritas, AlloDerm和 Permacol都比PeriGuard顯示出更多的細胞外基質分解。然而植入后12個月，只有Veritas體現出了最高水平的細胞外基質分解。值得強調的是，除了Veritas，其他三種材料的細胞外基質分解指標在植入1和6個月時都是穩定增加而沒有顯著區別，并未顯示出材料來源和是否交聯的差別。（圖3C）
未交聯的材料在植入后1個月6個月的分析顯示出，其材料支架結構的降解明顯快于交聯材料。Veritas的材料支架降解最快，AlloDerm其次。在植入后12個月，Veritas仍顯示出降解程度高于其他材料。在所有的植入時間點，Veritas都顯示出了這樣的特性（圖3D）。只有Permacol在植入后12個月觀察到其降解程度顯著高于其植入1個月和6個月后。
纖維化覆蓋程度的評價顯示出，Veritas的分數更高，表明它的纖維化覆蓋程度很低，這是植入后1個月的觀察結果。植入后6個月，AlloDerm和Veritas的分數相似，它們的纖維化覆蓋程度比交聯材料都要低。然而，植入12個月以后交聯材料顯現出纖維化覆蓋程度降低，顯示出這樣的過程可能反轉了。在植入12個月以后，只有Peri-Guard的纖維化覆蓋程度高于Veritas。（圖3E）
最后，在植入1個月和6個月時，兩種未交聯的材料有明顯的神經血管長入，而交聯材料沒有這樣的顯著現象發生。在植入12個月以后，Verita和AlloDerm這一指標明顯好于Peri-Guard，但與Permacol相當。Permacol在植入6個月到12個月期間，神經血管長入有所增加，到12個月時，其程度與未交聯的材料相當（圖3F）。所有四種材料在植入后都顯示出神經血管長入的特性，而且逐漸增加。每一時間點增加的情況可以在圖4的照片中顯示出。
圖 3 組織學評分的分項結果
圖4 蘇木精-曙紅染色結果（100X）
討論
雖然市場上有14種生物材料的補片，然而對疝補片長期植入效果的對比評價卻還沒有。本研究利用動物腹壁修復模型對比研究了四種生物疝補片材在長期植入后的生物力學和組織學差異。雖然生物材料更適用于傷口污染的情況，然而本研究還是在清潔環境下使用。材料在有菌情況下的使用不包含在本研究內。
我們開始認為腹壁修復的強度會隨所選擇植入材料初始強度的增加而增加。令人意想不到的是，沒有一種修復材料植入后其強度顯著強于豬的自體腹壁，這樣的結果表明植入材料并不能增加腹壁的修復強度。然而我們并沒有分析對比不用補片直接縫合修補的情況，可能在傷口愈合部位，補片還是會增加修復的強度。此外，雖然四種材料顯示了不同的初始強度，在植入1個月，6個月，12個月，它們的強度就都沒有明顯差別了。總之，材料的初始強度似乎和修復時間長度沒有關聯。
修復位置對強度的影響也似乎關系不大。這可能顯示出材料本身的支架降解過程中新的組織長入了植入材料，所以材料強度不會隨植入時間而減弱。除了應力特性以外，材料的初始剛度也是影響修復的因素。剛度可以簡單的描述為材料抵抗外力的變形（拉伸）程度。在疝修復應用中，材料需要抵抗腹壁隆起和疝的復發。然而修補材料的剛度不能過大，剛度過大的材料會由于無法拉伸而導致患者在呼吸、彎腰時感覺不舒服。我們的一些列測試表明材料的剛度與豬的自體腹壁組織材料并沒有明顯差異。雖然四種材料的初始剛度有差別，在植入1個月，6個月，12個月時差別基本消失。總之，材料的剛度差別也不會由于植入時間不同而影響修復，對剛度最大的材料Permacol也是如此。同樣的，初始剛度很小的材料（AlloDerm和Veritas）也沒有發生明顯的修復后腹壁突起或疝的復發。
應該注意到，生物材料都是膠原材料，其剛度取決于其測量時的應變水平。應變是材料伸長量和初始長度的比值。小應變情況下，膠原材料的剛度和大應變下是不同的。高應變區域材料受到的載荷也接近達到峰值，可以解釋為腹壁的大抻拉時材料產生大變形。在本研究中，AlloDerm的初始剛度明顯大于Veritas。然而，本研究得到的剛度數據實在大應變下得到的。很多小載荷產生的小應變情況沒有考慮，這可能也是有些彈性比較大的材料（如表皮）表現出比其他材料（如心包）的剛度更小。
在評價重構特性時，我們采用了綜合組織學指標評分的方式對比不同的材料。結果顯示，未交聯的材料比交聯的材料有更好的重構性。兩種未交聯的材料中，Veritas的綜合評分要高于AlloDerm，而且大多數分項指標也有明顯的優勢。這個綜合評分參考了6項重要的材料重構中組織學特征，可以反映出材料在修復過程中的表現。當我們需要綜合考慮時，結合六項而不是孤立指標的分析是非常重要的。例如，在材料支架降解和細胞滲透以及新的組織血管長入方面需要平衡。當植入材料的組織支架無法檢測到時，我們就認為它已經降解了。如果沒有其他指標總額和分析，僅僅憑材料的組織框架降解并不能反映重構程度。綜合細胞外基質分解指標才能反應重構程度。目前還無法評價細胞外基質分解和植入材料降解之間的比例對長期疝修復的影響。
組織學分析還反應了Veritas在植入后1個月的評分最高，此后6個月12個月的分數基本沒有變化，除了長入細胞類型和神經血管長入持續的增加。AlloDerm和Veritas的趨勢基本一致，在植入早期也獲得了很高的分數而且以后變化不大。這兩種未降解材料的組織學評價差異主要是細胞外基質分解以及材料組織支架降解方面有所不同，Veritas在這兩方面的分數要高于AlloDerm。這樣的差別顯示出不同的材料來源（心包和表皮）以及其他處理/滅菌工藝會對材料的這些特性造成影響。然而，其他特性，比如細胞滲透長入、修復處長入細胞類型以及神經血管長入方面材料的這些差異影響不大。
交聯材料（Peri-Guard和Permacol）的組織學評價分數比未交聯材料的要低，特別是在植入后1個月。然而隨著植入時間的增加，這些差別逐漸消除。例如，Peri-Guard和Permacol在植入1個月和6個月都顯示出細胞滲透的增加，在6個月的時候基本和未交聯材料程度一致，一致保持到12個月。結果表明，交聯材料在初始階段對細胞長入有阻礙，而所有的4種材料在隨后的時間段細胞滲透情況基本相同。也就是說，長期來看，交聯并沒有影響細胞滲透長入。
一般來說，交聯材料在植入12個月的時間段內所有組織學評價分數都有所增加。在植入后12月，交聯材料的評價分數與AlloDerm基本一致，Veritas的而分數最高。這說明除了交聯以外，其他因素，諸如材料來源和其他處理工藝也會在動物實驗模型中體現出對長期植入的影響。
對未交聯材料，在植入1個月和6個月后，其材料支架降解程度都比交聯材料要高。這個結論支持交聯工藝使得材料在短時期內抵抗降解的說法，因為它增加了材料的膠原結構連接。未交聯材料中，Veritas 相比AlloDerm更容易降解，說明除了交聯以外，還有其他因素也會影響材料的支架降解速度。Veritas, AlloDerm, 和 Peri-Guard在植入后1個月達到材料支架降解的最大值， 只有Permacol在研究的整個植入階段降解程度在不斷加大，表明不同交聯的方式也會對材料的降解速度產生不同的影響。
同樣地，未交聯的材料在植入后1個月和6個月其纖維化覆蓋程度要比交聯材料輕，表明交聯使得植入后短期內材料受到宿主的排異反應更大。所有四種材料中，Veritas的纖維化覆蓋程度是最低的，而且不隨植入時間的增加而變化。其他三種材料在植入開始階段都體現了一定的纖維化覆蓋程度，隨著植入時間的推移，纖維化覆蓋程度有所降低。最終12個月時只有Peri-Guard的纖維化覆蓋程度要高于Veritas，其他兩種材料和Veritas相當。這樣的結果表明，纖維化覆蓋的過程是可以反轉的。雖然交聯材料使得其初始造成纖維化覆蓋程度增加，在植入6個月以后，該過程反轉，到12個月時，和未交聯材料的纖維化覆蓋程度基本相當。Peri-Guard材料在所有植入時間段纖維化覆蓋程度都比較高，這表明除了交聯以外的其他因素可能也會影響宿主對材料的排異。
總之，實驗數據分析表明，雖然交聯的差異使得材料在組織學上與未交聯材料有一定差異，如細胞滲透，神經血管長入等，長期植入后，這些差異基本消失。有可能其他一些因素，包括材料來源，其他處理工藝（脫細胞和滅菌工藝等）也會影響材料長期植入后的生物相容性。雖然交聯工藝對生物材料支架的降解特性影響較大，但是否交聯也不能作為影響修復區域強度和剛度的單獨評價標準。
結論
本研究識別了四種生物材料的不同特點。由于影響因素眾多，每個患者對材料的生物學反應也有個體差異，加上臨床操作的不同，但很難給出哪種材料在腹壁修復中具有更好的生物相容性的結論。今后的研究還將著重對比材料來源以及除了交聯工藝之外的其他工藝差別的影響，如脫細胞和滅菌工藝。
